真菌毒素主要是由曲霉菌、青霉菌和镰刀菌产生具有生物毒性的次级代谢产物。真菌毒素广泛存在于各种食品原料及其加工产物中。对人和动物有害的常见真菌毒素主要有黄曲霉毒素B 1 （ AFB 1 ）、赭曲霉毒素A（OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、T-2毒素、伏马菌素（FB）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等。 荧光法是利用光照射某一物质后能发射反映该物质特性的荧光，对该物质进行分析的方法。
河南农业大学食品科学技术学院的卢美君、宋莲军*、河南省科学院同位素研究所有限责任公司范家霖*等对基于荧光共振能量转移效应的荧光传感器在真菌毒素检测中的应用进行了综述，旨在为食品安全提供快速检测参考。
荧光信号发生改变是基于不同的荧光响应机理。常见的荧光响应机理有光诱导电子转移、内滤效应、荧光共振能量转移（FRET）、分子内电荷转移等，其中FRET效应原理简单、灵敏性高，是应用场景范围最广、最基础的一种响应机理。
FRET是一种基于偶极-偶极相互作用所导致的从激发态供体到非激发态受体的非辐射能量转移。在该机理中，供体荧光团最初吸收入射光激发产生的能量，并将激发能量转移到附近的发色团，即能量受体，供体能量减少，返回其电子基态或跃迁到低能级，荧光减少或者猝灭，荧光寿命减少，量子产率降低。而受体吸收供体发射的能量，荧光强度、荧光寿命增加，通过荧光光谱观测到供、受体荧光强度的变化。若能量受体只吸收而不发射荧光，FRET效应只会诱导供体荧光猝灭。简单地说，供体的荧光强度比其单独存在时低，而受体的荧光强度大幅度提升，在此过程中没有光子参与，所以是非辐射的。并不是存在能量供体和能量受体就可以发生FRET效应，需要满足以下条件：供体的发射光谱与受体的吸收光谱之间有较好的重叠（一般要求大于30%），但重叠面积过大会影响精度和稳定能力；供体和受体之间的间距不大于10 nm，FRET发生的效率与供体和受体分子之间距离的六次方呈反比，这使得FRET对距离的微小变化十分敏感，所以通常通过缩短供体和受体分子之间距离提高FRET发生的效率；供体发射偶极矩和受体吸收偶极矩的相对取向，供、受体的偶极矩平行分布时的FRET效率要比两者相互垂直时高；供体和受体的分子间相互作用力需要足够强，才能使其成为FRET对。当能量受体为荧光物质时，供体的激发光谱和发射光谱要分别与受体的激发光谱和发射光谱没有重叠，避免供、受体同时激发而产生假阳性信号。图1为FRET的机理示意图。
荧光传感器是以荧光作为响应信号的光学生物传感器，主要由产生荧光信号的荧光基团、识别目标分析物的识别基团和连接体3 个部分所组成。识别基团通过连接体与靶标相互作用引起荧光基团信号发生改变，进而实现靶标的检测。待测物质可以使荧光基团的荧光信号发生改变，可以通过紫外灯光下荧光信号的变化程度与被检测物质浓度的关系快速定量检测目标分析物。定量分析时，温度、pH值等外因也会影响荧光的强度，所以要对外因来优化和统一。荧光传感器对目标分析物的响应模式大致上可以分为荧光增强、荧光猝灭和比率型荧光检测，其中增强型荧光传感器的应用最广泛。荧光传感器最大的优点是选择性好、灵敏度高。
AFB1被认为是毒性最强的黄曲霉毒素，具有肝毒性和致癌作用。基于量子点（QDs）的高量子产率、较强的光稳定性、大斯托克斯位移等特性，Zekavati等研发了一种基于FRET效应的增强型荧光传感器用于灵敏测定AFB1（图2a）。制备了QDs-AFB1抗体和罗丹明123（Rho123）标记AFB1-白蛋白偶联物，此时体系中抗原/抗体复合物是稳定的，QDs和Rho123之间会发生强烈的FRET效应。当AFB1加入时，会竞争取代Rho123标记的AFB1-白蛋白，使得FRET效应被抑制，QDs的荧光强度恢复。荧光强度的变化与AFB1浓度在0.1～0.6 μmol/mL范围内呈线 mol/L。
比率型荧光传感器由于其内置校准功能，能够大大减少外界信号的干扰，从而受到更多的关注。硫磺素T（ThT）是一种无标记荧光染料，化学稳定性高且荧光背景低，已被应用于构建荧光传感器。Fan Yaoyao等设计了一种无标记双发射荧光传感器定量检测AFB1（图2b），成本更加低廉。ThT和反式-2-[4’-(二甲基氨基)苯乙烯基]-3-乙基-1,3-苯并噻唑（DMASEBT）两种荧光探针分别作为能量供体和受体、嵌入适配体的B72作为捕获探针，当AFB1存在时会替代ThT和DMASEBT与B72结合，中断FRET效应，使ThT和DMASEBT荧光强度降低，所以能在两个波长处观察到对AFB1的荧光响应；该双发射传感器检验测试限为0.01 ng/mL，对AFB1具备优秀能力的选择性，能够适用于检测复杂的样品，为定量检测AFB1提供新思路。
黄曲霉毒素中 AFB 1 的毒性最强，所以对于AFB 1 的限量标准要求要高于其他真菌毒素，因此，对检测 AFB 1 的传感器要求更加严格。在实际样品检测中，基质干扰物的存在会导致传感器灵敏度下降，还需逐步提升传感器的灵敏度，优化抗干扰能力。
OTA能够抑制肾脏内葡萄糖的生成和细胞内蛋白质的合成，具有肾毒性、肝毒性、免疫抑制和“三致”作用，被列为2B级致癌物质。由于单壁碳纳米角（SWCNHs）在通常情况下会聚集形成球形结构，这种结构能增强SWCNHs和单链DNA（ssDNA）之间的π-π相互作用，使得ssDNA吸附在SWCNHs上。Guo Zhijun等根据此设计了一种荧光增强型传感器检验测试OTA（图3a）：将适配体与荧光染料SYBR Gold结合，增强了SYBR Gold的荧光强度；在没有OTA存在的情况下，与SYBR Gold结合的适配体会由于π-π堆叠相互作用吸附在SWCNHs上，SWCNHs作为荧光猝灭剂会猝灭SYBR Gold的荧光；当存在OTA时，吸附在SWCNHs上的适配体构象发生改变，与SWCNHs分离，SYBR Gold的荧光恢复，通过观察荧光恢复程度特异性检测OTA。
Tian Jiuying等将合成的胶体氧化铈纳米粒子和石墨烯量子点（GQDs）设计成与OTA适配体互补的探针DNA1@氧化铈纳米粒子和DNA2@GQDs（图3b）。氧化铈纳米粒子和GQDs会通过静电相互作用吸附在一起，发生FRET效应。体系中加入OTA适配体会与探针结合，中断FRET效应。由于OTA与其适配体的特异性亲和力，随着OTA的加入，游离适配体慢慢地减少，FRET效应逐渐恢复，450 nm和360 nm波长处的荧光强度比值也会随着OTA浓度的增大而增加。
上述检测的新方法结合了荧光传感器和适配体的优点，增加了检测的灵敏度和特异性，但是真实样品中基质复杂、真菌毒素种类非常之多且结构相似，会降低OTA与其适配体的特异性，增加检测的难度，这是目前检测OTA面临的主要挑战。
ZEN具有非类固醇雌激素作用，可诱发生殖毒性和“三致”作用，还可以抑制DNA和某些mRNA的合成。Sun Yuhan等设计了1 种由3 个结构域组成的多功能探针，其中富含C的5’端为模板合成银纳米团簇（AgNCs），作为能量供体；位于探针中部的适配体序列特异性识别ZEN；富含G的3’端可以明显提高AgNCs的荧光强度；以MIL-101（Fe）为前体物合成的Fe3O4/C作为能量受体，构建了增强型荧光传感器（图4a）：在没有ZEN存在时，能量受体通过π-π堆积相互作用吸附ZEN适配体，猝灭AgNCs的红色荧光；随着ZEN加入到体系中，会与适配体形成ZEN/适配体复合物，导致能量供体与能量受体之间的π-π堆积作用力减弱，距离逐渐增大，AgNCs的荧光显著地增强。通常与ZEN共存的真菌毒素对该荧光传感器的特异性影响较小，可以有实际效果的减少许多潜在因素的干扰。在0.01～250 ng/mL的线 ng/mL。
Li Taihua等利用抗原-抗体之间的FRET效应检测ZEN：ZEN和ZEN抗体分别作为能量受体和能量供体（图4b），由于阳离子表面活性剂在碱性pH值条件下固有的荧光性质，缓冲溶液选择碳酸氢钠并添加十六烷基三甲基溴化铵，使ZEN在280 nm激发波长处有最高的荧光强度。随着分析物浓度的增加，ZEN/ZEN抗体浓度增加，抗原/抗体发射强度比增强，基于荧光强度比的变化特异性检测ZEN。该系统能在20 min内完成检测，不需要标记和洗涤。
ZEN广泛存在于粮食作物中，粮食中杂质较多，需要复杂的预处理，延长了检测时间并增加了检测成本，现阶段荧光传感器还不能广泛地用于大批量检测实际样品，还需逐步优化，促进荧光传感器商业化。
T-2毒素被认为是毒性最强的A型单端孢霉毒素，是许多作物中常见的污染物。T-2毒素由于对人和动物具有心脏毒性、肝毒性、消化毒性等多系统毒性已受到广泛关注。其中影响生殖功能是T-2毒素最主要的毒性。Khan等制备了一种聚丙烯酸@L-精氨酸@6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇纳米颗粒（-AuNCs NPs)，PAA可以有效的预防AuNCs的聚集。聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）是一种水溶性阳离子聚合物，可以使AuNPs聚集，还可以与ssDNA相互作用形成双链体。在没有T-2毒素存在的情况下，PDDA和T-2毒素适配体结合形成双链体，没有游离的PDDA与AuNPs相互作用，AuNPs不会聚集。由于FRET效应，分散的AuNPs会猝灭-AuNCs NPs的绿色荧光；当T-2毒素存在时，适配体与T-2毒素结合，游离在体系中的PDDA使AuNPs聚集，肉眼可以观察到颜色的改变。聚集的AuNPs对-AuNCs NPs的荧光影响较小，随着靶标浓度的增加，荧光逐渐恢复（图5a）。溶液荧光信号的恢复程度与加入毒素的浓度有关。该荧光增强型传感器检验测试的结果与商用ELISA之间没有显著差异。
DON是一种主要由镰刀菌产生的B型单端孢霉烯族化合物，能够引起恶心、呕吐，对人体产生广泛的毒性作用。林先锋制备了ssDNA-UCNPs和MXene-Au复合纳米片分别作为RNA引导获得性免疫系统中的能量供体和能量受体，DON适配体作为系统中的激活序列；当DON存在时，会与适配体结合，抑制体系对ssDNAUCNPs的反式切割能力，导致上转换纳米粒子吸附在纳米片上，发生FRET效应，引起荧光猝灭。该方法拥有非常良好的选择性、重现性和抗离子干扰能力。
展青霉素（PAT）是一种主要由曲霉菌和青霉属真菌产生的次级代谢产物，经常在发霉的水果及其衍生水果产品中检测到，具有细胞毒性、基因毒性和诱变作用。Deng Jiankang等选择两种结构性染料作为荧光探针，开发了一种基于适配体识别检测PAT的比率型荧光传感器（图5b）。由于Apt PAT 和cDNA合成的双链体（S1-S2）对核酸外切酶具有抗性，当PAT不存在时，SYBR Green I（SGI）染料会与双链体结合发出荧光；当PAT存在时，优先与适配体结合，核酸外切酶作用于双链体，导致S1释放并与另一染料N-甲基中卟啉IX（NMM）结合，SGI荧光强度降低，NMM荧光强度增加，相对荧光强度与PAT浓度呈线性关系。
荧光传感器在各类真菌毒素的检测中都显示出巨大的潜力，但在真实样品的检测中基质复杂、真菌毒素种类非常之多且结构相似等问题，有几率会使假阴性或假阳性结果，增加检测的难度，这对于检测真菌毒素是一种挑战。
多种真菌毒素的联合暴露会对生物体产生协同毒性效应。随着荧光传感器技术的逐渐完备，一种荧光传感器能同时检测多种真菌毒素。Suo Zhiguang等基于双交叉DNA纳米结构设计了一种用于同时检测OTA和AFB1的荧光传感器（图6a）：黑洞猝灭剂-2（BHQ-2）会与Cy3和Cy5发生FRET效应，导致Cy3和Cy5的荧光猝灭；用Cy3和Cy5分别标记OTA适配体和AFB1适配体。由于适配体对于靶标的亲和力更高，当OTA和AFB1存在时，适配体优先与这两种真菌毒素结合，可以从荧光光谱图观察到570 nm和670 nm波长处的荧光增强。这种增强型荧光传感器能够有很大成效避免背景信号影响，还可以实现同时检测样品中的OTA和AFB1，检测限分别为0.005 8、0.046 0 ng/mL，该方法为同时检测多种真菌毒素提供了思路。
Chen Ruipeng等使用8 个单链寡核苷酸构建出三维镊子纳米结构用于识别和检测OTA、ZEN（图6b）。其荧光强度的变化是由于Cy3、Cy5和BHQ-3、BHQ-2的FRET效应导致，当OTA和ZEN存在时，控制镊子开关的中间部分会与真菌毒素结合，减小荧光团和猝灭剂之间的距离，导致荧光猝灭，荧光强度可用于定量测定OTA和ZEN的浓度。
一种真菌可以产生一种或多种真菌毒素，所以能同时检测食品中多种真菌毒素是十分必要的。上述方法说明同时检测多种真菌毒素慢慢的变成了可能，为真实样品中多种真菌毒素同时检测提供思路。但是真菌毒素分子结构相似，有可能会出现假阴性或假阳性结果，还需提高检测的特异性。
综上所述，荧光传感器具有选择性高、操作便捷、响应速度快等诸多优点。表1对不一样的荧光传感器进行了比较，其中增强型、猝灭型荧光传感器是基于单个荧光信号强度的改变，原理简单、易于构建、操作便捷，能够直观地观察到荧光的变化，但单一信号改变容易受到外因的影响，它的灵敏度较低，易产生误差。比率型荧光传感器能同时测量不同波长下的两个荧光信号，通过荧光强度比值与目标物浓度的变化关系定量检测目标分析物，能够降低浓度、光源强度等外因的影响，荧光颜色可以随着目标物浓度的变化而变化，实现可视化检测，这对目标物实时监测具备极其重大意义。
本文重点介绍了基于FRET效应的荧光传感器在食品中常见真菌毒素检测的应用。基于FRET效应的荧光传感器能够在紫外灯光下观察到荧光颜色的变化，有助于实现可视化检测，且具有简单易操作、检测速度快、样品消耗少、不需要复杂的处理、准确度高等优点。微量真菌毒素就会对机体造成危害，基于FRET效应的荧光传感器灵敏度较高、选择性好，能够很好的满足许多国家和监督管理的机构的最大限量标准，在真菌毒素的检验测试方面具有广阔的应用前景。但该检测技术任旧存在一些问题。在实际样品检测中，干扰物多、检测环境复杂，所以仍需提高荧光传感器的抗干扰的能力。大多数荧光传感器仍处于实验室研究阶段，将荧光传感器批量生产，应用于市场还有待改进。随技术的慢慢的提升，荧光传感器也会愈加完善和成熟，将来必会在检验测试领域发挥更大的作用。
本文《基于荧光共振能量转移效应的荧光传感器在真菌毒素检测中的应用》来源于《食品科学》2024年45卷11期293-300页. 作者：卢美君，王田林，李天歌，乔明武，马燕，黄现青，范家霖，宋莲军. DOI:10.7506/spkx0619-149. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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